1. Стерилизация насыщенным паром под давлением

2. Стерилизация текучим паром

Стерилизация паром под давлением – самый эффективный метод в микробиологической практике способ стерилизации, т.к. с его помощью быстро и надежно достигается стерилизация. Этот способ основан на том, что пар, образующийся при кипячении воды, не выходит наружу, а скапливается в замкнутом пространстве и повышает давление. Соответственно с повышением давления увеличивается температура кипячения воды:

Давление Температура

(атмосферы) °С

Стерилизация паром под давлением производится в автоклаве (стерилизаторе), обычно стерилизуют до 1 избыточной атмосферы, что соответствует температуре 119-120°С. Таким способом в течение 15-20 минут стерилизуют: 1) заразные материалы и зараженную посуду; 2) приборы с резиновыми деталями; 3) питательные среды, не содержащие нативного белка и углеводов. Некоторые питательные среды (сахара) стерилизуют при 0,5-0,7 ат., что соответствует 112-115°С.

Для контроля стерилизации среди стерилизуемого материала помещают ампулы с химическими веществами, плавящимися при определенной температуре, смешанные с красителем. При достижении в камере определенной температуры порошок плавится, образуя сплав, окрашенный в цвет добавленного красителя.

Таблица 10. Показатели температуры плавления порошков-индикаторов

	Температура плавления, С°	Название химического вещества-индикатора	Температура плавления, С°
Бензонафтол		Резорцин чистый
Антипирин		Бензойная кислота
Серный цвет

Примечание: на 100 г порошка-индикатора добавляют 0,01 г сафранина, 0,005 г фуксина или метиленовой сини.

Стерилизация текучим паром. Текучим паром стерилизуют при температуре 100°С. Для этой цели существует текучепаровой аппарат – аппарат Коха. Можно стерилизовать текучим паром и в автоклаве с открытым краном. Стерилизацию проводят в течение 30-40 минут с момента выделения пара. Однократная стерилизация текучим паром не обеспечивает полного обеспложивания, т.к. при температуре 100°С погибают только вегетативные формы микробов, споры сохраняют жизнеспособность. Полное обеспложивание достигается лишь при повторных стерилизациях. Поэтому этот метод стерилизации называется дробной стерилизацией. Суть этого ме­тода заключается в том, что после первой стерилизации материал остав­ляют при комнатной температуре, давая оставшимся спорам прорасти в вегетативные формы, на следующий день стерилизацию при 100°С повто­ряют. Оставшимся в меньшем числе спорам опять дают прорасти, оставляя при комнатной температуре, и через сутки снова стерилизуют при 100°C. После третьей стерилизации при 100°С материал полностью освобожден от бактерий и спор.

Таким образом, стерилизация текучим паром проводится в аппарате Коха или автоклаве при 100 °С 3 дня подряд по 30 минут. Текучим паром стерилизуют такие материалы, которые портятся или разлагаются при сте­рилизации паром под давлением (молоко, желатин, среды с углеводами).

Тиндализация – метод дробной стерилизации, предложенный Тиндалем для веществ, не переносящих температуру 100°С (сыворотка крови, витамины). Материал подвергают нагреванию в течение 5-6 дней подряд при 56-58°С по 1 часу ежедневно. Тиндализацию проводят на водяной бане с терморегуляторами.

Стерилизация инфракрасными лучами. Этот метод стерилизации осно­ван на способности инфракрасных лучей, при поглощении веществом, нагревать это вещество. Инфракрасные лучи не обладают специфическим дей­ствием на микроорганизмы, последние погибают не от лучей, а от высокой температуры. Этот метод используют для стерилизации ряда хирургичес­ких инструментов. Для этого выпускают специальные инфракрасные печи с глубоким вакуумом.

Стерилизация ультрафиолетовыми лучами. Этот вид стерилизации проводится с помощью любого источника ультрафиолетовых лучей, чаще всего используют бактерицидные лампы. Эти лампы представляют собой ртутные газоразрядные светильники из фиолетового стекла. Ультрафиолетовые лучи оказывают на микробы бактерицидное действие. Этот метод стерилизации применяют для обеззараживания воздуха и поверхностей различных помещений в клиниках и лабораториях, предметов и оборудования, воды и пи­щевых продуктов.

Механическая стерилизация – фильтрование. Этот метод широко используется в микробиологической практике как для стерилизации жидкостей: лечебных сывороток, токсинов, анатоксинов, питательных сред и лекарственных препаратов, так и воздуха.

Аппараты, служащие для отделения взвешенных частиц от жидкой среды, называются бактериальными фильтрами. Бактериальные фильтры бывают фарфоровые или керамические, в которых фильтрование осуществляется через специально обработанный слой каолина - свечи Шамберлана, Бейкфельда; стеклянные, в которых фильтрующей поверхностью являются пластины из мелкопористого стекла; асбестовые - с фильт­рующей пластиной из клетчатки - фильтр Зейтца; мембранные или коллоидные, фильтрующие пластины, которые изготовлены из нитроклетчатки и ацетилцеллюлозы.

При температуре 132 градуса - давление 2 кгс/ кв.см в течение 20 мин.

При температуре 120 градуса – давление 1,1 кгс/ кв.см в течение 45 мин.

Стерилизуют перевязочный материал и операционное белье в паровых стерилизаторах в биксах или в мешках из плотной материи (с завязками типа кисета) Герметичность биксов, которые используются для стерилизации перевязочного материала и операционного белья обеспечивается зажимающим устройством, благодаря которому ободок плотно прижимается к стенке бикса. Исправность этого устройства необходимо проверять каждый раз перед закладкой в бикс материала, если герметичность нарушена, то содержимое бикса инфицируется. Перед закладкой бикса проводится 2-х кратная гигиеническая обработка бикса с внешней и внутренней стороны бикса. Используемый для упаковки материал, простыни или салфетки, используемые для накрытия стерильного стола, один раз в неделю подвергаются стирке. При стерилизации материала в мешках упаковывают материал в два мешка, надетых один поверх другого. Все материалы укладываются вертикально таким образом, чтобы можно было сразу найти нужное, не вынимая из бикса ничего лишнего. Все материалы укладываются рыхло, чтобы пар свободно проникал в глубину между бельем и внутрь рулонов. Каждый бикс должен иметь маркировку с указанием сведений о содержимом, дате стерилизации, а также отделения, которому принадлежит бикс. В каждый бикс помещается индикатор для контроля стерильности, так как должна быть полная уверенность в том, что произошло полное уничтожение микробов (обеспложивание).

Паровую стерилизацию контролируют разными методами. Можно, например, регистрировать высокую температуру и продолжительность стерилизации при этой температуре. Используют также термочувствительные химические индикаторы, которые наносят на внешнюю сторону каждой упаковки. Они не свидетельствуют о стерильности предметов внутри упаковки, а показывают, подвергалась ли упаковка стерилизации. При стерилизации больших упаковок индикатор помещают и внутрь нее. Внешний индикатор показывает, проник ли пар в упаковку.

Бактериологический контроль качества паровой стерилизации проводят не реже 1 раза в месяц, проводится санитарной службой. Используются стандартные бактериологические индикаторы, содержащие дозированное количество спор микробов, которые особо устойчивы к действию горячего пара, и их гибель говорит о полной стерильности предметов. Если автоклав исправен и режим стерилизации соблюден, споры обычно гибнут. Однократное прорастание спор не обязательно свидетельствует о не стерильности обработанных предметов. В этом случае необходимо проверить режим стерилизации (температуру и длительность), правильность загрузки автоклава и его эксплуатации, а затем повторить пробу.

Стерилизация текучим паром производится в текучепаровом аппарате Коха или в автоклаве при незавинченной крышке и открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном. Пространство между верхней и нижней пластинками дна заполняют на 2/3 водой (для спуска оставшейся после стерилизации воды есть кран). Крышка аппарата имеет в центре отверстие для термометра и несколько небольших отверстий для выхода пара. Стерилизуемый материал загружают в камеру аппарата неплотно, чтобы обеспечить возможность наибольшего контакта его с паром. Началом стерилизации считается время с момента закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру. В текучепаровом аппарате стерилизуют, главным образом, питательные среды, свойства которых изменяются при температуре выше 100°С. Стерилизацию текучим паром следует проводить повторно, так как однократное прогревание при температуре 100°С не обеспечивает полного обеззараживания. Такой метод получил название дробной стерилизации: обработку стерилизуемого материала текучим паром проводят по 30 минут ежедневно в течение 3 дней. В промежутках между стерилизациями материал выдерживают при комнатной температуре для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях.

Тиндализация.

Тиндализация-дробная стерилизация с применением температуры ниже 100°С, предложенная Тиндалем. Прогревание стерилизуемoгo материала производят в водяной бане, снабженной терморегулятором, по часу при температуре 60-65°С в течение 5 дней или при 70- 80°C в течение 3 дней. В промежутках между прогреваниями обрабатываемый материал выдерживают при температуре 25°С для прорастания спор в вегетативные формы, которые погибают при последующих прогреваниях. Тиндализацией пользуются для обеспложивания питательных сред, содержащих белок.

Механическая стерилизация с помощью бактериальных ультрафильтров. Бактериальные фильтры применяют для освобождения жидкости от находящихся в ней бактерий, а также для отделения бактерий от вирусов, фагов и экзотоксинов. Вирусы бактериальными фильтрами не задерживаются, и поэтому ультрафильтрацию нельзя рассматривать как стерилизацию в принятом значении этого слова. Для изготовления ультрафильтров применяют мелкопористые материалы (каолин, асбест, нитроцеллюлоза и др.), способные задерживать бактерии.

Асбестовые фильтры (фильтры Зейтца) представляют собой асбестовые пластинки толщиной 3-5 мм и диаметром 35 и 140 мм для фильтрации малых и больших объемов жидкости. В нашей стране асбестовые фильтры, изготовляют двух марок: «Ф» (фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие бактерии, и «СФ» (стерилизующие), более плотные, задерживающие бактерии. Перед употреблением асбестовые фильтры монтируют в фильтровальные аппараты и вместе с ними стерилизуют в автоклаве. Асбестовые фильтры используются однократно. Мембранные ультрафильтры изготавливаются из нитроцеллюлозы и представляют собой диски белого цвета диаметром 35 мм и толщиной 0,1 мм.

Бактериальные фильтры различаются по величине пор и обозначаются порядковыми номерами (табл. 2).

Непосредственно перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют кипячением. Фильтры помещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50- 60°С, чтобы предупредить их скручивание, кипятят на слабом огне в течение 30 минут, меняя 2-3 раза воду. Простерилизованные фильтры во избежание их повреждения вынимают из стерилизатора фламбированным и остуженным пинцетом с гладкими кончиками.

Для фильтрации жидкостей бактериальные фильтры монтируют в специальные фильтровальные приборы, в частности, в фильтр Зейтца.

Он состоит из 2-х частей: верхней, имеющей форму цилиндра или воронки, и нижней-опорной части аппарата, с так называемым фильтровальным столиком из металлической сетки или чистой керамической пластинки, на которую помещают мембранный или асбестовый фильтр. Опорная часть аппарата имеет форму воронки, суживающаяся часть которой находится в резиновой пробке горлышка колбы Бунзена. В рабочем состоянии верхнюю часть прибора фиксируют на нижней с помощью винтов. Перед началом фильтрации места соединения различных частей установки для создания герметичности заливают парафином. Отводную трубку колбы присоединяют толстостенной резиновой трубкой к водоструйному, масляному или велосипедному нacocy. После этого в цилиндр или воронку аппарата наливают фильтруемую жидкость и включают насос, создающий вакуум в приемном сосуде. В результате образующейся разности давлений фильтруемая жидкость проходит через поры фильтра в приемник. Микроорганизмы остаются на поверхности фильтра.

(автоклавирование)~ самый эффективный метод стерилизации (тем­пература выше 100 X). Осуществляют его в специальном аппара­те-автоклаве. Принцип стерилизации основан на том, что чис­тый насыщенный водяной пар при высоком давлении, конденси­руясь, повышает температуру внутри котла (автоклава). Уменьшение объема пара после конденсации способствует про­никновению его во внутрь стерилизуемого предмета."

Вертикальный автоклав (рис. 29, А) представляет собой ци­линдрической формы двустенный металлический котел, сверху закрываемый герметично крышкой. Через специальный кран с воронкой между стенками заливают воду до определенного уров­ня. Внутренняя стенка котла в верхней части имеет отверстия, в нижней части котла - кран, через который при нагревании воды пар вытесняет воздух из котла автоклава. Сверху на автоклав на­девают металлический защит­ный каркас, причем между ним и самим автоклавом дол­жно быть свободное простран­ство. Автоклав нагревают электричеством. После загруз­ки автоклава крышку и кран, через который наливают воду, закрывают, нижний кран вре­менно остается открытым. На­греваемая вода между стенка­ми автоклава кипит, образую­щийся пар поднимается вверх

Рис. 28. Электрическая водяная баня:

I - корпус; 2 - термометр-регулятор; 3 - крышка; 4- панель управления

и через верхние отверстия внутренней стенки проходит во внутрь котла, толчками вытесняя воздух через нижний открытый кран. Когда воздух весь вытеснится и пар начнет выходить ровной струей, нижний кран закрывают. В результате давление пара внутри автоклава повышается. Началом стерилизации считают момент достижения показания манометра заданной величины. Нагрев регулируют на протяжении всей стерилизации, поддер­живая давление на одном уровне. При чрезмерном давлении в автоклаве предусмотрен предохранительный клапан, через кото­рый избыток пара выходит наружу. Современные автоклавы снабжены автоматическим устройством, регулирующим режим работы. При повышении давления пара соответственно повышается и температура в автоклаве; так, при давлении 50,6 кПа температура будет 110...И2Х, При 101,ЗкПа - 120...I21, при 151,9кПа-124...126, при 202,6 кПа - 132...133 X.

Манометры регистрируют давление пара без учета окружающе­го атмосферного давления {760 мм рт. ст.). По истечении времени стерилизации автоклав отключают. После охлаждения при нуле­вом показании манометра открывают ан для спуска пара. Крышку автоклава подают осторожно на себя, не заглядывая в ко­тел, оберегая лицо от возможного воздействия остаточного пара. До полного выхода пара открывать крышку автоклава нельзя, так как при быстром падении давления внутри автоклава стерилизуе­мые жидкие среды закипают, пробки из пробирок выталкиваются вместе с жидкостью.

Рис. 29. (Внизу)Схема вертикального и горизонтального автоклава:

/(- вертикальный автоклав: /-подставка; 2 - водомерная трубка; 3- воройка; 4-предох­ранительный клапан; 5- манометр; й- крышка; 7-винтовые зажимы; S- котел; 9- кожух;

10- камера стерилизации; // - водопарокая камера; /2 -паровыпускной клапан. Я -горизонтальный автоклав: У -постамент; 2 - нагревательный элемент; 3 - крышка кот­ла; 4-предохранительный клапан; J-вентиль; 6- кожух; 7-паровая камера; 8- стерили-зационная камера; 9 - манометр паровой камеры; 10 - трехходовой кран; // - сифонная трубка паровой камеры; 12 - опорное кольцо; 13 - крышка паровой камеры; 14- штурвал; /5-впускной кран; /6-манометр котелка; 17- трехходовой кран котелка; 18- сифонная трубка котелка; 19- патрубок; 20- воронка; 21 - водоуказательная колонка; 22- котелок

При повышении давления пара соответственно повышается и температура в автоклаве; так, при давлении 50,6 кПа температура будет 110...И2Х, При 101,ЗкПа - 120...I21, при 151,9кПа-124...126, при 202,6 кПа - 132...133 X.

Манометры регистрируют давление пара без учета окружающе­го атмосферного давления {760 мм рт. ст.). По истечении времени стерилизации автоклав отключают. После охлаждения при нуле­вом показании манометра открывают кран для спуска пара. Крышку автоклава подают осторожно на себя, не заглядывая в ко­тел, оберегая лицо от возможного воздействия остаточного пара. До полного выхода пара открывать крышку автоклава нельзя, так как при быстром падении давления внутри автоклава стерилизуе­мые жидкие среды закипают, пробки из пробирок выталкиваются вместе с жидкостью.

В автоклаве стерилизуют питательные среды, выдерживающие нагревание выше 100 °С, стеклянную посуду, завернутую в бумагу, перевязочный материал, халаты, помещенные в металлические биксы. Кроме того, обеззараживают использованные бактериаль­ные культуры, посуду. В этих случаях давление пара и экспозиция стерилизации продолжительнее (151,9кПа- 1 ч), чем при стери­лизации чистого материала (50,6..Л01,ЗкПа - 30...40 мин).

Для проверки качества работы автоклава, соответствия показа­ний манометра и температуры пара используют различные веще­ства (бензонафтол, антипирин, сера), имеющие определенную точку плавления. Небольшое количество данного вещества сме­шивают с таким же количеством краски (фуксин, метиленовая синь), помешают в пробирку, запаивают ее и устанавливают в вер­тикальном положении между стерилизуемым материалом. При должной температуре вещество-индикатор плавится и окрашива­ется в цвет использованного красителя.

Устройство горизонтальных автоклавов конструктивно отлича­ется от вертикальных, но принцип действия остается таким же.

Стерилизация фильтрованием. Осуществляется пропусканием материала через бактериологические фильтры. Фильтрация связана не только с пропусканием или задержкой фильтром мельчайших частиц (бактерий) в зависимости от вели­чины пор фильтрующей пластинки, но и с адсорбционной спо­собностью материала, из которого сделан фильтр. Обычно фильтруют жидкости, не выдерживающие нагревания (сыворотки, растворы антибиотиков и др.). При фильтрации

Рис. 30. Фильтр Зейтца:

/ - стеклянная колба Бунэена; 2 - канюля для отсасывания воздуха; 3 - металлический держатель; 4 - фильтр

ные пластины из смеси асбеста с целлюло­зой. Отечественные асбестовые фильтры имеют марки Ф2 и СФ. Стерилизующими являются фильтры марки СФ.

Мембранные (ультра-) фильтры (колло-дийные мембраны) имеют вид тончайших листков белой бумаги. Готовят их из геми-целлюлозы, обработанной соответствую­щими реактивами, температурой и прессо­ванием. Эти фильтры различают по диа­метру и величине пор. Используют их для фильтрации, концентрации частиц, содер­жащихся в фильтруемой жидкости, а также для определения вели­чины вирусов.

Стерильность полученных фильтратов проверяют посевом на питательные среды с последующим выдерживанием в термостате несколько дней.

Стерилизация ультрафиолетовым излу­чением (УФИ). В лаборатории источником УФ-излучения обычно служат специальные бактерицидные лампы. УФ-облуче-ние используют для обеззараживания воздуха в помещениях (бок­сах, операционных). Бактерицидные лампы нашли также приме­нение в торговле и пищевой промышленности при хранении раз­личных продуктов при температуре выше 0 °С.

Ультразвук. Используют определенную частоту как фи­зический стерилизующий фактор, например для обеззараживания соды, стерилизации молока, некоторых консервированных про­дуктов, кожевенного сырья.

Химические методы. Для стерилизации питательных сред и ла­бораторной посуды непригодны. Их чаще используют для консер­вирования некоторых субстратов, так как они в бактерицидных концентрациях парализуют ферментативную способность бакте­рий.

В некоторых случаях для стерилизации применяют биологичес­кие МЕТОДЫ.

Стерилизация сухим жаром

Фламбирование, или прокаливание

Методы стерилизации

Стерилизация , или обеспложивание (от лат. sterilis - бесплодный), - это полное уничтожение клеток микроорганизмов в питательных средах, посуде и пр.

Известно несколько методов стерилизации. Чаще всего применяют стерилизацию нагреванием.

Прокаливать можно непосредственно перед употреблением платиновые петли, иглы, шпатели, мелкие металлические предметы (ножницы, ланцеты, пинцеты), а также стеклянные палочки, предметные, покровные стекла и т. д.

Ее применяют для обработки посуды и сухих материалов, например крахмала, мела. При этом стерилизуемым объект выдерживают при 170 °С в течение 2 ч (считая с того момента, как установлена необходимая температура) в печи Пастера (рис. 8, а) или в электросушильных шкафах. Поднимать температуру выше 170 °С не рекомендуется: ватные пробки и бумага начинают разрушаться (буреют, становятся ломкими).

Перед стерилизацией стеклянную посуду закрывают ватными пробками и обертывают бумагой. Чашки, пробирки, пипетки, вату, марлю заворачивают в бумагу или помещают в особые футляры и пеналы, в которых стерильная посуда может храниться после стерилизации.

По окончании стерилизации шкаф открывают только после того, как температура снизится до комнатной, иначе стекло может лопнуть.

Текучим паром (100 °С) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдерживающие более высокой температуры (среды с углеводами, МПЖ, молоко). Проводят стерилизацию в кипятильнике Коха(рис. 8, б) по 30 мин в течение 3 сут ежедневно. Такая стерилизация называется дробной .

Кипятильник Коха - высокий металлический цилиндр с двойным дном, свободно закрывающийся конусообразнойкрышкой с отверстием для термометра. Снаружи цилиндр покрыт асбестом или линолеумом. На дно кипятильника наливают воду, устанавливают подставку с отверстиями дляпрохождения пара, на которую помещают стерилизуемые предметы. Продолжительность стерилизации отсчитывают с моментаинтенсивного выхода пара из-под крышки и повышениятемпературы до 100 °С.

При однократном прогреве при температуре 100°С в течение 30 мин погибают вегетативные клетки, споры же многихмикроорганизмов остаются жизнеспособными. После такого прогрева среду помещают на 24 ч в термостат при 28-30 °С. Споры, сохранившиеся при первом нагревании, успевают за это время прорасти в вегетативные формы, которые погибают при последующем нагревании. Затем эту операцию повторяют еще 2 раза.